小小肽|酪蛋白磷酸肽的研究进展-王莹莹（学术文章）
王玉莹1 ，陈锡威2 ，冯凤琴3*，宋俊梅1*
1. 齐鲁工业大学食品与生物工程学院（济南 250353）；2. 杭州Bsports必一食品科技有限公司（杭州 310000）；
3. 浙江大学生物系统工程与食品科学学院（杭州 310058）
摘 要 酪蛋白磷酸肽是一种含有磷酸丝氨酸的生物活性肽, 具有促进人体对钙、铁、锌等矿物质的吸收以及预防龋齿等多种生物学功能。主要介绍了酪蛋白磷酸肽的生理功能和应用, 并对其检测方法进行了简要的总结。
关键词 酪蛋白磷酸肽; 生理功能; 应用; 检测
Research Progress in Casein Phosphopeptides
Wang Yu-ying1 , Chen Xi-wei2 , Feng Feng-qin3*, Song Jun-mei1*
1. School of Food and Bioengineering, Qilu University of Technology (Jinan 250353);
2. Hangzhou Kangyuan Food Science and Technology Ltd (Hangzhou 310000);
3. School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University (Hangzhou 310058)
Abstract Casein phosphopeptides, a kind of bioactive peptides with phosphoserine cluster, have many biological functions such as promoting the absorption of calcium, iron, zinc and other divalent minerals in human body, preventing caries and so on. This article mainly introduced the physiological function and application of casein phosphopeptides, and brieflfl y summarized the detection methods of CPPs.
Keywords casein phosphopeptides; physiological function; application; detection
酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）是以牛奶酪蛋白为原料，经过单一或复合蛋白酶的水解，通过生物技术制得的具有生物活性的多肽。在碱性条件下，CPPs可防止钙、铁等离子的沉淀，从而促进其吸收，因此CPPs被称为“矿质载体”。随着钙强化剂的推广应用，CPPs在日本、东南亚、欧洲、澳大利亚等地已被广泛应用于钙强化乳制品、果汁饮料、蛋白饮料和速溶饮品、运动食品、糖果、营养素补充剂以及防龋齿口香糖中。我国现在已经将CPPs作为食品添加剂广泛用于婴幼儿奶粉、钙铁锌等矿物质补充食品及营养保健食品中。
1 CPPs的结构及性质
1.1 CPPs的结构
CPPs有α和β 2种构型，分别由α-酪蛋白和β-酪蛋白水解分离纯化生成，其主要功能区是αS1(59-79)5P和β(1-28)4P，活性中心是成串的磷酸丝氨酸和谷氨酸簇，其结构可表示为-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-，现已证明该核心结构是发挥 CPPs生物活性必不可少的部分。CPPs分布于αS1-酪蛋白和β-酪蛋白等牛乳蛋白的不同区域，所以不同的酶作用于酪蛋白生成的CPPs的分子量不同，而且，动物体内分离到的CPPs分子链比体外水解产物短，因此，其磷酸解离常数也不同。
1.2 CPPs的物理性质
CPPs产品具有良好的溶解性，在pH 2.0～10.0内，其溶解性除在pH 4.0约为90％外，其它均高于90％，且溶解性随pH的增高而增大。CPPs产品较酪蛋白具有更好的起泡性和泡沫稳定性。CPPs产品乳化力较好，其乳化力较酪蛋白下降了约20%，乳化性下降了2.89%，乳化稳定性下降了1.45倍。在CPPs产品加工时可以进行有效的杀菌处理，在100 ℃条件下杀菌30 min不会对产品外观造成改变。CPPs作为钙、铁吸收促进剂，Ca2+的存在不会影响产品的色泽[1]。
2 CPPs的生理功能
2.1 促进矿物元素的吸收
国内外针对CPPs促进钙吸收的研究比较多，其中，促进钙吸收的机理已经日趋明朗化。钙在肠道中必须以离子的形式才能被吸收，在小肠前段维生素D作为钙吸收促进剂可加强钙在小肠前段的主动吸收。而在小肠后段钙的吸收形式是被动扩散，吸收效率取决于小肠内钙离子的游离浓度，但是钙离子在中性和弱碱性环境下易与酸根离子形成不溶性盐而流失[2]。大量的研究表明，CPPs带有高浓度的负电荷，既可以抵抗消化道中各种酶的水解，又可以与钙结合成可溶物，从而有效地防止钙在小肠中性或偏碱性环境中形成磷酸钙沉淀，同时它还可以有效地增加钙在体内的滞留时间，该结合物在被肠壁细胞吸收后才把钙释放出来。近年来，关于CPPs促进钙吸收的研究主要集中影响其结合能力的因素方面，如CPPs/Ca、N/P、CPPs分子结构等。
1950年，Melland er[3]首次从酪蛋白的胰蛋白酶水解物中分离得到CPPs，并且证明，CPPs可增加钙的生物利用率，在缺乏维生素D的情况下，患有佝偻病的小孩服用酪蛋白的胰酶消化液可强化骨骼的钙化。Lee等[4]进一步研究证明CPPs可增加大鼠小肠末端可溶性钙的含量。Sato[5]等报道，当老鼠饲料中含有CPPs或酪蛋白时，将会增加其大腿组织中放射性标记的钙含量。此外，CPPs/Ca会影响钙的吸收。Daniela等试验结果表明，CPPs与Ca比例为0.37时对提高矿质元素运输是最有效的。Erba[6]研究发现CPPs对大鼠远端小肠钙的被动转运的积极作用取决于CPPs与Ca在肠腔内的相对量。在他的研究中，CPPs/Ca=15时对矿物转运最有效。
国内对于酪蛋白磷酸肽的研究起步较晚，冯凤琴等[7~8]探讨CPPs的N/P、分子大小与结合钙的能力之间关系，发现N/P较�。�CPPs制品中分子量较小部分所占的比例较大，则结合钙的能力较强。随后又证明CPPs作用效果不仅与N/P有关，还和分子中氨基酸组成和顺序或磷酸基分布有关。生庆海等[9]研究认为CPPs/Ca值为4时能显著促进大鼠钙的吸收和利用，提高股骨的骨钙含量，增加骨密度。Zong等[10]利用6种合成磷酸肽（SPP）和酪蛋白磷酸肽（CPPs）研究磷酸肽分子结构与其结合钙特性之间的关系，研究表明，在模拟肠道环境中，磷酸丝氨酸残基的数量和位置是结合钙活性的重要因素，含有2个不连续磷酸丝氨酸的磷酸肽——SPP4是所有试验的磷酸肽中钙吸附效率最高的。
此外，CPPs还能促进动物对其它矿物元素的吸收和利用。Andrew等研究表明，水解产物CPPs由于暴露出的Ser-P能阻止Fe的沉淀，从而提高Fe的生物利用率，并且发现Fe的利用率和体内的碱性磷脂酶有关。对大鼠试验表明，在含肌醇六磷酸饲料中添加CPPs，Zn的吸收利用率提高约10％～50％[11]。P. Etcheverry等[12]综合研究了CPPs对钙、铁、锌、硒等的生物利用率。另外，CPPs对提镁的生物利用率也有一定作用，还可作为铁、锰、铜、硒的载体，是一种良好的金属结合肽。
2.2 防止龋齿
龋齿表现为无机质的脱矿和有机质的分解，是口腔主要的常见病，其特点是发病率高，分布广，世界卫生组织已将其与癌肿和心血管疾病并列为人类3大重点防治疾病。而CPPs可用于防止和治疗龋齿，近年来，对于CPPs的研究主要集中在这一功能。研究表明，CPPs在溶液中能与非结晶型磷酸钙结合成复合体，即酪蛋白磷酸肽钙磷复合体（ casein phosphopeptides-amorphous calcium phosphate，CPP ACP）。CPPs作为一种含多个磷酸丝氨酸的蛋白质，既有稳定钙磷离子的作用，又有促进磷酸钙相分离的作用。而非结晶型磷酸钙（ACP）是从牛奶中提取的具有生物活性的钙离子和磷酸盐离子，能被牙面吸收。1997年，Reynolds[13]已经证明CPP-ACP是可溶性复合物，可以附着在龋损处，维持高水平的钙离子浓度，促使钙离子进入龋损区，促进早期龋损再矿化，从而有效地防止牙蚀细菌的侵蚀，起到抗龋齿的作用。Cross等[14]的研究也证明早期牙釉质损伤的修复就是源于这一复合体。他们认为CPPs形成磷酸钙运载工具，这阻止了牙釉质去矿化并促进了再矿化。Yamaguchi等[15]通过超声波脉冲在无破坏情况下测定牙釉质结构的去矿化和再矿化，得出高浓度CPP-ACP中含有的无机成分可增强牙釉质再矿化的结论。喻明玲等[16]用显微硬度测量法研究CPPACP对碳酸饮料酸蚀后的牙釉质的再矿化作用，研究表明，CPP-ACP能促进钙盐沉积于脱矿釉质表面而提高酸蚀牙釉质的显微硬度，显著促进酸蚀釉质再矿化。
用CPPs制成的抗龋齿添加剂是目前唯一不同于氟化物的添加剂。
2.3 增强动物机体免疫力
CPPs结构中起免疫调节作用的部位是含有3个氨基酸残基的小肽，且N端和C端分别是一个磷酸丝氨酸残基，即SerP-X-SerP结构[2]。CPPs通过Ser-P钙离子形成复合物阻止磷酸钙沉淀的产生从而促进钙离子的吸收，而钙离子能够通过改变脂分子功能来帮助T淋巴细胞活化，提高其对外来抗原的敏感性，从而帮助机体清除病原体提高免疫力。CPPs还通过调节淋巴细胞因子的水平来调节动物免疫功能。
2.4 其它生理功能
CPPs还具有促进动物体外受精和诱导细胞凋亡等生理功能。目前，CPPs促进动物体外受精的作用机理尚不十分清楚，可能与溶解状态钙离子介导的精卵细胞融合有关，也可能与谷氨酸的游离羧基有关。酪蛋白磷酸肽的促肿瘤细胞凋亡的作用已经在人肠上皮腺瘤细胞HT-29细胞、Caco细胞、白血病细胞HL-60以及神经胶质瘤细胞PC12等细胞模型中得到证明。
3 CPPs的应用
CPPs是以从天然牛乳中提取的酪蛋白为原料水解分离得到的功能性食品因子，因此不存在安全问题。谢玮等[17]进行的安全性毒理学评价试验结果表明：聚烯烃成核剂的小鼠急性毒理试验，根据急性毒性分级标准，CPPs属实际无毒物质（Ames试验），小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验说明该物质不具遗传毒性作用。因此在食品中添加该物质是安全可靠的。
3.1 CPPs在食品中的应用
目前在国外市场上已有含CPPs的许多适用于儿童、老人、孕妇等不同人群的各种保健食品。日本某公司推出的一种铁骨饮料，就是以含促进钙吸收的CPPs为其主要的成分；还有另外几家日本的食品公司也推出了添加CPPs的饼干；丹麦也于1991年实现了CPPs的商品化。此外，美国、德国、法国等国家均进行了积极的研究。90年代，我国的广州轻化所开始进行CPPs的研究，现已通过技术鉴定，并实现工业化生产。近年来，中国的2家企业已经将CPPs作为营养强化剂添加到3段幼儿配方乳粉中。
商品CPPs在5 ℃和25 ℃保存2年后，其防止钙沉淀能力指标基本没有变化。在酸化条件下，CPPs溶解经受120 ℃/15 min处理，功能指标仍达95％以上，说明CPPs能完全满足严格的超高温瞬时灭菌（UHT）加工要求，在酸性条件下更为稳定。在碱性条件下，稳定性较差，随受热温度提高和受热时间延长，脱磷酸基反应会加剧，CPPs的功能会受到影响。在一般使用条件下，CPPs的结构和功能都是稳定的。
徐曼[18]等研究了食品加工过程中不同的因素对CPPs持钙能力的影响，结果表明，短时高温加热未对CPPs的持钙能力造成太大影响；葡萄糖有加速磷酸钙沉淀的作用，葡萄糖浓度与加速沉淀的关系总体趋势为先减小后增大；添加淀粉可使磷酸钙沉淀形成的时间推迟5 min~10 min；添加苯甲酸钠可使磷酸钙沉淀时间推迟10 min左右；添加柠檬酸可使磷酸钙沉淀的时间大大推迟。李书国[19]在制备酸豆乳饮料的工艺中，添加了酪蛋白磷酸肽，使产品更富有营养保健价值，同时口感和风味更佳。胡志和[20]在研究通过食品加工条件对CPPs在pH 8.0时延缓磷酸钙沉淀形成能力的影响中表明，CPPs最好应用于含蛋白质高、碳水化合物低的食品中。赵祥忠[21]对保健雪米饼的研制中加入了酪蛋白磷酸肽，提高了钙的吸收利用率，使强化后的产品品质有了提高；CPPs在饮料中的应用显示出其独特的优点，可保持钙、铁在饮料中的稳定性，有助于形成良好的风味。
因此，将CPPs作为一种功能性食品基料，应用于烘焙食品、甜点、冷冻食品、果子、乳酸菌饮料、果汁饮料等食品中，对提高人民生活质量和健康水平有着广阔的市场前景和社会效益。
3.2 CPPs在动物生产中的应用
CPPs能显著提高仔猪血清中的IgG、IgA、IgM等抗体水平，从而增强了仔猪的免疫力。周根来等[22]研究表明酪蛋白磷酸肽对断奶仔猪生长有一定的促进作用，添加0.3% CPPs对仔猪日增重和料肉比的影响较明显。断奶仔猪日粮中添加0.3%酪蛋白磷酸肽能提高仔猪的免疫功能，对血清免疫球蛋白IgA、IgG和外周血淋巴细胞增殖的影响显著（p＜0.05）。
CPPs可以促进蛋鸡对钙、铁、锌等矿物质的吸收，增强了蛋鸡的体质，减少了蛋鸡腿病的发生，提高了蛋壳的强度，从而降低了产蛋鸡的破蛋率。Ashida等[23]试验表明，在正常钙水平的日粮中添加CPPs可增强蛋鸡骨骼的强度，在低钙日粮中添加0.5% ～1.0%的CPPs可改善蛋壳的品质。李如兰等[24]在0～6周龄肉仔鸡基础日粮中添加0.25%～1.00%的酪蛋白磷酸肽均能不同程度地提高肉仔鸡平均日增重，降低料重比，其中以添加0.50%时的经济效益最好，研究表明，在日粮中添加酪蛋白磷酸肽能够明显改善肉仔鸡的生产性能。
CPPs还可以显著提高种畜的繁殖性能。由于CPPs可促进公猪精子对钙离子的吸收，因此CPPs可使猪精子穿透率较早地达到最大，CPPs可使精子保持较长时间的穿过能力。
综上所述，CPPs充分显示了其在饲料业上的开发应用潜力，在动物生产中的应用主要是作为功能性的饲料添加剂使用，有些国家已将CPPs作为功能性添加剂应用于饲料工业中。
3.3 CPPs在药物中的应用
CPPs是从天然蛋白中提取的多肽，具有致敏性小、无细胞毒性、安全可靠的优点，因此充分运用这些特点，可用于对佝偻�。揽撇『凸侵适杷芍⒌燃膊〉闹瘟疲恢瞥煽怪姥栏啵谝夯蚝龋绨拇罄悄敬笱Ы�CPPs加入一种糖果中，发现这种糖果诱发龋齿的几率大大降低；广州某公司成功研制一种CPPs有机钙牙膏，这种新型牙膏投放市场后，仅2个月销售额突破4 000万元[25]。另外，还可将CPPs制成促进动物体外受精和细胞融合的生化制剂等[26]。
4 CPPs的检测方法
随着CPPs作用机理、生理功能等方面基础研究的不断深入和钙强化剂的推广应用，国内外将CPPs作为功能性食品添加剂添加到饲料及食品中，我国仅仅把它作为促钙吸收剂。目前，国内外对于CPPs的检测方法主要有乙醇沉淀法、钼蓝比色法、直接定磷法、等电聚焦电泳法（IEF）和高效液相色谱法（HPLC）等等。
作为食品添加剂的CPPs产品含有多种磷酸肽、非磷酸肽及少量的游离氨基酸的混合物，通常采用乙醇沉淀法测定其中磷酸肽含量，但该法专属性差，不能用于食品中添加CPPs的测定。钼蓝比色法和离子交换-高效液相色谱法（IE-HPLC）[27]等可测定CPPs中磷酸基团的含量，但是由于CPPs中磷酸基团的数目并不是确定的，所以也无法测定CPPs的含量。
庞广昌等[28]对直接定磷法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法、聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF）法进行比较：直接定量法测定CPPs，方法操作简单，不需要很昂贵的仪器设备，重复性强，适于生产控制，但是测定结果偏高，而且该方法必须有除去无机磷和非蛋白含磷物的试验，否则不能用于测定CPPs含量；SDS-PAGE法测定CPPs，该方法所测定的是各条含磷蛋白带的含磷量，所以不需要对样品进行无机磷和非蛋白磷的测定，但是该方法比直接定磷法要复杂得多，需要电泳仪等仪器设备、较多的化学药品和操作技巧；IEF法除具有SDS-PAGE法测定CPPs的所有优点外，其精确性、稳定性和可操作性都是最好的，另外它还可以用于对提取方法进行评价，因为通过该方法可以同时得到CPPs各组分的等电点，而等电点是进行蛋白、多肽提取、分离的重要参数。本方法的缺点是需要电泳仪器设备，两性电解质较昂贵，操作也需要一定的训练。结果表明：这3种方法都可以用来对CPPs进行定量测定，但适用于不同情况，直接定磷法适用于产业测定；SDS-PAGE适用于CPPs的组分测定；而IEF则适用于较精确的测定。
牟光庆等[29]用毛细管区带电泳（CZE）对CPPs进行了分离和测定，并研究出适宜电泳操作条件。试验结论为本方法前处理简便、检测灵敏度高，适用于保健食品钙片中CPPs含量的测定，但是容易受食品中蛋白质及一些盐类成分的干扰。
Lemieux等[30]将分子筛色谱与反相高效液相色谱法（RP-HPLC）联用，成功分离并鉴定多种CPPs。Miquel等[31]采用RP-HPLC-ESI-MS/MS第1次成功地分离出12种CPPs。但该2种方法所需设备昂贵，对操作人员素质要求高，不太适应生产质量监控和产品测定。周杏琴等[32]用反相C18液相制备色谱柱，经过2次不同梯度的洗脱，得到了4种不同组分的CPPs。田随安等[33]将保健食品样品处理后，采用不同比例的乙腈、0.1%醋酸溶液梯度洗脱，用带有紫外检测器的高效液相色谱仪测定。赖奕坚等[34]用液相色谱-质谱联用法（LC-MS），以选择离子模式（SIM）检测钙片中CPPs含量，冯凤琴等[35]采用HPLC测定奶粉中CPPs的含量，试验结果表明，2种方法前处理简便，专一性好，灵敏度高。虽然HPLC或与其它方法联用优点较多，但是由于不同的厂家生产的CPPs标志峰含量存在差异，所以制作标准曲线时需要利用所使用厂家生产的CPPs作为标品，这也是高效液相色谱法存在的缺陷。
5 结语
由于我国民众膳食组成以植物性食物为主，其中含有大量的影响钙、铁、锌吸收因子，如植酸、草酸、纤维素等，没有大量消费乳制品的习惯，所以缺钙尤为严重。随着生活水平的提高，人类钙营养不足的问题备受关注，尤其是婴儿和老年人。CPPs是安全性高的钙促进因子，作为一种营养强化剂不断地被添加到很多保健品中，但是，国内外对于其检测方法仍没有相应的标准。因此，寻找一种更加精确、灵敏度更高、适用性更强的检测方法成为当务之急。
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